Электронная библиотека ДВГМУ МОНОНУКЛЕАРНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННО-ЧУВСТ

Мононуклеарные клетки периферической крови

Имеющиеся данные об экспрессии и морфологии ЛАК весьма малочисленны и достаточно противоречивы. Поэтому целью настоящей работы являлось изучение морфологических, функциональных и иммунофенотипических особенностей ЛАК в разные сроки культивирования.

Через 36 часов, 3, 5, 9, 10 суток после начала культивирования из центрифугата надосадочной жидкости культур,содержащих мононуклеарные клетки крови донора, были сделаны мазки, которые окрашивались на РНК по Браше с контрольной обработкой РНК-азой, эозин-азуром по Романовскому-Гимза, реактивом Шиффа по Шабадашу с контролем амилазой на гликоген и гликозаминогликаны. В окрашенных по Браше мазках подсчитывалось процентное содержание выявляемых клеток. Проводилась статистическая обработка данных с использованием программы «ИП-СО» (Россия).

Исследование иммунофенотипа ЛАК позволило установить,что эти клетки активно экспрессируют на своей мембране активационные молекулы «CD-38»,молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса (HLA-DR).ЛАК характеризуются высоким уровнем молекул адгезии (CD-58).

Цитологическое изучение МНК при инкубации с ИЛ-2 позволило установить, что через 3 суток количество лимфоцитов существенно возрастало и продолжало прогрессивно увеличиваться до 10 суток, при этом отмечалось появление бластных форм. Наиболее ранние изменения отмечались на 3 сутки инкубации, когда среди мононуклеаров преобладали пиронинофильные лимфоциты. Большое количество бластных форм и пиронинофильных лимфоцитов сохранялось вплоть до 10 суток инкубации с ИЛ-2.

Таким образом, при воздействии ИЛ-2 на МНК крови здоровых доноров происходила пролиферация и активация клеток лимфоидного ряда — генерация ЛАК. При этом зрелые лимфоциты подвергались бласттрансформации и характеризовались морфологически как пролимфоциты и иммунобласты. В процессе дедифференцировки лимфоциты активизировались, о чём свидетельствовало накопление РНК в цитоплазме, проявляющееся в её яркой пиронинофильной окраске. Об активации лимфоцитов указывали также особенности иммунофенотипа ЛАК в виде повышенной экспрессии активационных антигенов и молекул адгезии. ЛАК обладали достоверно более высокой киллерной активностью по отношению к опухолевым клеткам. Максимальное количество ЛАК генерировалось на 3-5 сутки, и высокая киллерная и пролиферативная активность сохранялась в течение 10 суток.

Полученные результаты подтверждают целесообразность использования ЛАК, полученных на 3-5 сутки инкубации для адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований, поскольку именно в эти сроки ЛАК обладают наиболее высоким уровнем пролиферативной и цитотоксической активности.

Мононуклеарные клетки периферической крови

ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Выделение мононуклеаров периферической крови

1. Готовят градиент. В центрифужную пробирку (объем 10—15 мл) с пробкой вносят примерно 3 мл смеси метризоат — фиколл . Пробирку оставляют на столе до тех пор, пока градиент не примет комнатную температуру. (При 4°С работать не рекомендуется.)

2. Берут кровь. Переливают ее в коническую колбу, в которой находится дюжина стеклянных бус диаметром 2 мм. Колбу осторожно вращают кистью руки до тех пор, пока уже не будут слышны удары стеклянных бус друг о друга и о стенку колбы, т. е. пока кровь не свернется. (Не следует забывать об инфекционной опасности, которую представляет кровь человека.)

3. Разбавляют дефибринированную кровь равным объемом среды (PBS или BSS) при комнатной температуре.

4. С помощью пастеровской пипетки аккуратно наслаивают разбавленную дефибринированную кровь на градиент. Кончик пипетки загнут под углом 90° и отрезан алмазным ножом вблизи изгиба, чтобы избежать при наслаивании перемешивания градиента с кровью. (Можно поступить иначе. Вначале поместить дефибринированную кровь в чистую центрифужную пробирку, а затем подслоить под нее смесь метризоат — фиколл.)

5. Центрифугируют при 1500 g- в течение 15 мин., при комнатной температуре. (Во избежание перемешивания для остановки ротора центрифуги не следует пользоваться тормозом.)

Читайте также:  Антивирусный набор россияне скупили средства от похмелья Статьи Известия

6. Эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а на границе раздела фаз находятся мононуклеарные клетки. Отсасывают прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем мононуклеаров. Затем по всей площади сечения пробирки на границе раздела фаз собирают слой мононуклеаров. Клетки, прилипшие к стенкам, можно собрать кончиком пипетки. Мононуклеары переносят в чистую центрифужную пробирку.

7. Разбавляют взвесь мононуклеаров не менее чем четырехкратным избытком среды и тщательно перемешивают. С этого момента обработку клеток можно проводить при 4 °С. Чтобы сконцентрировать МПК, взвесь центрифугируют при 300 g в течение 10 мин.

Например, для разделения клеток крови человека в градиенте плотности используют 9%-ный (вес/объем) раствор фиколла, чтобы приготовить градиент с плотностью 1,078 г/мл. Для разделения клеток крысы готовят 14%-ный (вес/ объем) раствор фиколла, чтобы окончательно градиент имел плотность 1,087 г/мл. Фиколл растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. К 24 объемам растворенного фиколла добавляют 10 объемов 32,8%-ного (вес/объем) раствора метризоата натрия

В качестве градиента плотности для разделения клеток крови можно использовать коммерческий препарат фиколл-400 (“Sigma-Aldrich” Швеция) или смесь фиколла с рентгеноконтрастными веществами с высокой плотностью (урографин, верографин, уротраст или изопак).

Фиколл – это фирменное название синтетического высокомолекулярного сополимера сахарозы и эпихлоргидрина. В иммунологических исследованиях используют 6,1%-или 9%-ные растворы фиколла с молекулярной массой 400 кДа (Фиколл 400). Для приготовления раствора фиколла его растворяют в теплой дистиллированной воде.

Приготовление градиента плотности фиколл-верографина

1. Подготовка фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколл-400 растворяют в 48 (96) мл дистиллированной воды.

2. Подготовка раствора рентгеноконтрастного вещества (в частности, верографина): 10.14 (20.28) мл 76% раствора верографина доводят дистиллированной водой до 21 (42) мл.

3. Подготовка градиента плотности: растворы фиколл-400 и верографина смешивают. С помощью ареометра измеряют плотность полученного раствора, которая должна составлять 1.077 г/см. Если плотность выше, чем необходимо, то добавляют раствор фиколл-400, если ниже — раствор верографина. Градиент плотности можно хранить в течение 30 суток при температуре + 4˚С в склянке из оранжевого стекла.

При отсутствии фиколл-400 градиент плотности можно приготовить только из одного рентгено-контрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раствора верографина смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45 (0.9) мл. фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Полученный при этом 14.3% раствор верографина имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве градиента плотности.

Следует отметить, что при применении метода седиментации в градиенте плотности для выделения лимфоцитов из общей суспензии форменных элементов крови необходимо использовать кровь доноров или животных, освобожденную от фибрина.

Готовят 0,2%-иый раствор красителя в PBS, содержащий 3 мМ NaN3, при продолжительном перемешивании. Перед использованием раствор центрифугируют для удаления агломератов красителя.

Натрий-фосфатный буфер. Phosphate buffered saline, PBS

Для приготовления 1 литра однократного натрий-фосфатного буфера используют:

растворяют в 800 мл дистиллированной воды доводят рН до 7,4 соляной кислотой или гидроксидом натрия добавляют дистиллированной воды до 1 литра.

Мононуклеарные клетки периферической крови

Мононуклеарная фракция в системе крови — это клетки, выделенные из костного мозга или периферической крови посредством отделения от эритроцитов, тромбоцитов и гранулоцитов на градиенте плотности.

МОНОЦИТОПОЭЗ

Моноцитопоэз берет свое начала от полипотентной клетки-предшественницы родоначальницы миелопоэзе с последующим развитием в Моноцитарный росток (П класс), продолжается в унипотентную клетку-предшественницу родоначальницу Моноцитов (Ш класс). Однако клеточные элементы, входящие во П и Ш классы морфологически не дифференцируемы. Морфологическое распознавание начинается с бластной клетки Моноцитарного ростка (1У класс) — монобласт, который через стадию Промоноцит, превращается в Моноцит.

Читайте также:  Капли от сухости глаз - для увлажнения и снятия усталости, виды препаратов, механизм действия и отзы

В отличие от клеток других линий, цикл созревания которых заканчивается в красном костном мозге, клетки Моноцитарного ростка окончательно созревают только в тканях, где Промоноцит и Моноцит трансформируются в Макрофаг.

Морфология клеток:

По мере дифференцировки монобласта в промоноцит и моноцит клетка претерпевает ряд морфологических и функциональных изменений (Рис. 7):

В красном костном мозге

1. Монобласт — диаметром 12-20 мкм. В норме его трудно отличить от миелобласта или недифференцируемого бласта, а также не всегда можно отличить от лимфобласта. Только отмеченные очертания ядра и более широкая светло-базофильная цитоплазма могут указать на развитие этого «бласта» в сторону моноцитарной клетки. Ядро нежной структуры содержит 1-2 нуклеолы голубоватого цвета. Цитоплазма голубого цвета, в ней могут присутствовать пылевидные азурофильные гранулы.

Рис. 7. Моноцитарный ряд клеток: А — монобласты, Б — промоноциты, В-моноциты.

2. Промоноцит — диаметром 15-20 мкм. В норме имеет ядро промиелоцита бобовидной формы, светло-фиолетового цвета. Хроматин нежный, крупносетчатый. В ядре 1-2 нуклеолы. Цитоплазма серо-голубого, дымчатого цвета с мелкой азурофильной зернистостью.

Промоноцит, являясь клеткой-предшественницей Моноцита, проходит 2 последовательных цикла деления до превращения в Моноцит, продолжительность митотического цикла составляет 30 часов. Промоноцит способен к пиноцитозу и фагоцитозу, хотя в меньшей степени, чем Моноцит и Макрофаг.

3. Моноцит — диаметром 16-18 мкм, различных морфологических вариаций по характеру и интенсивности окраски ядра и цитоплазмы. Ядра могут приближаться к округлым, бобовидным формам. Моноцит с более нежной структурой ядра и наличием ядрышек (или их остатков) можно отнести к Промоноциту. Цитоплазма сероватого или бледно-голубого цвета, в ней могут присутствовать многочисленные пылевидные азурофильные гранулы.

Дифференцировка Монобласта в Моноцит происходит в красном костном мозге в течение 5 дней. Моноцит в костном мозге находится в среднем 3 суток (минимальное время пребывания 9 часов), затем делится и, не образуя костномозгового резерва, выходит в периферическую кровь.

Моноцит — наиболее крупная клетка крови, здесь он созревает, ядро становится из круглого сначала бобовидным, затем лапчатым, меняется структура хроматина. В периферической крови обнаружен различный уровень дифференцировки Моноцитов, причем у здоровых людей преобладают более зрелые Моноциты. В незрелом Моноците есть остатки нуклеол, меняются ферменты в цитоплазме.

В крови Моноциты распределяются на пристеночные и циркулирующие пулы, обменивающиеся между собой, количественные соотношения которых могут меняться. У человека циркулирующий пул Моноцитов в норме 18х10 в 6 степени клеток/кг массы тела, а маргинальный пул, который в данный момент не принимает участия в циркуляции, примыкая к внутренней стенке микрососуда, в 3,5 раза больше (63х10 в 6 степени клеток/кг). В целом общий пул Моноцитов периферической крови составляют от 1 до 10% всех лейкоцитов (80-600 х 10 9/л).

Моноциты циркулируют в крови от 36 до 104 часов (1,5 — 4.5 суток) и затем покидают ее по стохастическому (целевому) принципу, взаимодействуя со специализированными адгезивными молекулами на эндотелиальных клетках. Миграция Мононуклеара из сосудистого русла в очаг воспаления происходит через участки микроциркуляторного русла с эндотелием второго типа — это посткапилляры и венулы.

Van Furth R. (1988): после попадания в ткань Мононуклеары крови превращаются в Макрофаги, которые в свою очередь адаптируются к микросреде их будущего обитания. Разнородность популяции Макрофагов «по горизонтали» — микросреда, в которой они функционируют.

Читайте также:  Суспензия; Дифлюкан; для детей инструкция по применению детского сиропа

Выйдя из кровеносного русла, Моноцит становится тканевым и больше не способен вернуться в циркуляцию. Тканевой Моноцит трансформируется в органо- и тканеспецифический Макрофаг согласно следующими стадиям перехода: макрофагальный бласт, промакрофаг, макрофаг. Макрофаг может образоваться из стволовой кроветворной клетки и из Промоноцита согласно тем же стадиям перехода.

4. Макрофаг (от греч. makros — большой, fagos — пожирающий) — гетерогенная специализированная клеточная популяция защитной системы организма (Рис. 8). Диаметром 15-80 мкм, форма клетки неправильная, ядро овальной или продолговатой формы. Продолжительность жизни исчисляется месяцами и годами.

Возможно образование Макрофагов: в соединительной ткани (гистиоциты), легких (альвеолярные), печени (купферовские клетки), селезенке, лимфатических узлах, костной ткани (остекласты), нервной ткани (микроглиальные клетки), коже (клетки Лангерганса), в плевральном выпоте и асците и т.д.

Макрофаги принимают активное участие: в неспецифической защите от патогенных микроорганизмов; в процессах репарации; инициации специфического иммунного ответа; в метаболизме липидов и железа; регуляции кроветворения; гемостазе; в секреции цитокинов и других биологически активных веществ, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность различных клеток.

По разнообразию фенотипических признаков Макрофагов можно судить о возможностях при трансформации Промоноцита и Моноцита и влиянии микроокружения. Макрофаг в сравнении с Промоноцитом и Моноцитом, по своим функциональным возможностям значительно превалирует. Значит, в процессе трансформации Макрофаг приобретает возможности, которые отсутствовали у Промоноцита и Моноцита.

Рис. 8. Макрофаги

Промоноциты, Моноциты и Макрофаги человека в патологических условиях, способны к пролиферации в ограниченных масштабах. Промоноцит из этого ряда наиболее пролиферирующая клетка и может, минуя стадию Моноцита, в тканях трансформироваться в Макрофаг.

Учитывая, что Мононуклеары относятся к иммунокомпетентной системе, вполне законно ожидать изменение их количественного и качественного состояния при различных патологических процессах. В частности это наглядно проявляется при хроническом воспалении, когда число Моноцитов увеличивается. Это увеличение отмечается в красном костном мозге, периферической крови, селезенке, лимфатических узлах, перитонеальных полостях. При этом в периферической крови обнаружен различный уровень дифференцировки Моноцитов, а также могут появляться и преобладать менее зрелые клетки — Промоноциты.

В ускоренном вариант пролиферации костномозговых Мононуклеаров получается: минимум 9 часов в красном костном мозге и 12 часов в кровеносном русле, итого 21 час. Для созревания Моноцита из Промоноцита необходимо два деления по 30 часов, т.е. при срочной потребности в Макрофагах, с учетом отсутствия костномозгового резерва, в кровеносное русло выходят Промоноциты и не зрелые Моноциты.

В процессе дифференцировки морфологически распознаваемые клетки при Моноцитопоэзе претерпевают от Монобласта до Макрофага 7-8 митозов. При воспалительных процессах количество Макрофагов и их активность особенно возрастают. Воспалительный инфильтрат может поддерживаться лишь в случае постоянного обновления Мононуклеарных фагоцитов в очаге за счет Моноцитов крови. В свою очередь пул Моноцитов восстанавливается из красного костного мозга. Следовательно, через Мононуклеарные фагоциты очаг хронического воспаления приобретает постоянные связи с костным мозгом, с центром генерации свежих Моноцитов. Очаг будет прогрессировать при избыточном Моноцитопоэзе и наоборот. В то же время в стимуляции Моноцитопоэза самое деятельное участие принимают активированные Макрофаги.

Таким образом, Промоноцит и Моноцит в системе кроветворения являются единственными промежуточными упрощенными универсальными клетками, которые в органах и тканях трансформируются в органо- и тканеспецифические Макрофаги.

Ссылка на основную публикацию
Электрическая зубная щетка Hapica Interbrush DBP-1W — «Hapica Interbrush электрический ёршик на стра
Ортодонтические зубные щётки для чистки брекетов Брекеты являются самыми эффективными ортодонтическими средствами и помогают скорректировать прикус. Но при наличии такой...
Экзема у грудничка причины у новорожденных, лечение у младенцев
Экзема: причины, виды, симптомы и методы лечения По статистике, около 10 % населения нашей планеты страдает от того или иного...
Экзистенциальная психология – определение, основные идеи, методы, положения, обучение
Экзистенциальная психология представители Согласно Р. Мэй, первым этапом развития экзистенциальной психологии следует считать феноменологию. [1] Представителями феноменологической стадии экзистенциальной психологии...
Электрические зубные щетки — как отличить миф от реальности
«Электрическую щетку чередуем с обычной». Стоматолог об уходе за зубами 9 февраля отмечается Международный день стоматолога. «АиФ-Черноземье» пообщался с главным...
Adblock detector